【摘要】 目的 考察硫酸长春新碱脂质体的体外释放度及其药效。方法 采用pH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体，用透析法测定其体外释放度和血浆释放度，通过抗小鼠S180肿瘤的抑瘤率评价药效。结果 硫酸长春新碱脂质体体外释放度符合零级动力学模型；聚乙二醇单甲醚2000胆固醇琥珀酸酯修饰的硫酸长春新碱脂质体释放度降低，抑瘤率显著提高。结论 长循环硫酸长春新碱脂质体降低药物释放度，提高药效。
【关键词】 硫酸长春新碱 脂质体 长循环脂质体 释放度 药效学
Abstract:Objective To investigate the release rate and pharmacodynamics in vitro of of vincristine sulfate liposomes. Methods Vincristine sulfate liposomes was prepared by pH gradient method. The release rate was measured by dialysis method. Pharmacodynamics of vincristine sulfate liposomes was evaluated by its antitumor efficacy. Results The release rate of vincristine sulfate liposomes in vitro was fitted to zeroorder model. After modification with longcirculating adjuvant， the release rate of vincristine sulfate liposomes decreased and antitumor efficacy increased obviously. Conclusion Longcirculating vincristine sulfate liposomes decrease release rate and increase curative effect.
　　Key words:vincristine sulfate; liposome; longcirculating liposome; release rate; pharmacodynamics
　　 硫酸长春新碱（vincristine， VCR）为长春花生物碱类抗肿瘤药物，对白血?⒘馨土鼍哂邢灾钚浴Ａ俅灿τ玫牧蛩岢ご盒录钗⑸浼粒嬖谧乓┪锇胨テ诙獭⒋豢臁⑸窬低澈臀赋Φ蓝拘郧康热钡恪Ｓ醒芯勘砻鳎侍遄魑怪琢鲆┪镌靥蹇梢愿纳埔┪锢砘灾省⑻岣吡菩А⒔档拖低澈吞囟ú课唬ㄈ缧脑唷⑸觯┑亩靖弊饔茫?］。Peter MK等人的研究也表明，硫酸长春新碱制成脂质体能改善药物体内行为、提高疗效、降低毒副作用［2］。因此，抗肿瘤药物与脂质体结合的处方设计越来越受到关注。
　　 本文采用主动载药法中的pH梯度法，以氢化大豆卵磷脂/胆固醇（HSPC/Chol）为脂质体膜制备硫酸长春新碱脂质体。考察硫酸长春新碱脂质体的释放度和抗小鼠S180肿瘤抑瘤率，同时考察长循环辅料聚乙二醇单甲醚2000胆固醇琥珀酸酯（CHSPEG2000）对释放度和抑瘤率的影响，以期为该药临床应用提供更好的给药剂型。
　　1 实验材料
　　1.1 试药
　　 硫酸长春新碱（广州环叶制药有限公司），硫酸长春新碱对照品（中国药品生物制品鉴定所），氢化大豆卵磷脂（HSPC，德国），胆固醇（Chol，药用，温州市瓯海食品生化厂），CHSPEG2000 (聚乙二醇单甲醚2000胆固醇琥珀酸酯，自制)，阳离子树脂（上海树脂厂），其他试剂均为分析纯。
　　1.2 仪器
　　 P230高效液相色谱仪（大连依利特），FC204分析天平（上海精科仪器厂），电热恒温水浴锅（大连医疗器械厂），PHS25型pH计（上海精科雷磁），DF101磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂），透析袋（美国VIKASE公司），M110L型微射流仪（美国microfluids公司）。
　　1.3 动物
　　 小白鼠（18～22 g，沈阳药科大学实验动物中心，SCXK 辽2005-008）；家兔（2～3 kg，沈阳药科大学实验动物中心，SCXK 辽2005—008）；S180肿瘤（辽宁省肿瘤研究所）。
　　2 方法与结果
　　2.1 pH梯度法制备硫酸长春新碱脂质体及包封率测定［3］
　　2.1.1 HPLC条件
　　色谱柱：Kromasil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水二乙胺(体积比70∶30∶0.5)（磷酸调pH7.0）；柱温：35 ℃；流速：1.2 mL/min；紫外检测波长：298 nm。
　　2.1.2 空白脂质体的制备
　　 将HSPC、Chol按2∶1（质量比）混合，加适量无水乙醇，65 ℃水浴中加热溶解，挥除乙醇，加枸橼酸缓冲液(0.3 mol/L，pH 4.30)，65 ℃水化30 min，用微射流仪循环数次，依次通过0.8和0.45 μm的微孔滤膜整粒，得空白脂质体。将HSPC、Chol、CHSPEG2000按2∶1∶0.2（质量比）混合，其他操作同上，得长循环空白脂质体。
　　2.1.3 硫酸长春新碱脂质体的制备
　　 取空白脂质体0.2 mL、硫酸长春新碱溶液（1.0 g/L）1.0 mL和Na2HPO4溶液（0.375 mol/L；pH 9.0）0.8 mL混匀（pH 7.3），于60 ℃孵化10 min，得硫酸长春新碱脂质体。取长循环空白脂质体同法操作，得长循环硫酸长春新碱脂质体。

　　2.1.4 硫酸长春新碱标准曲线制备
　　 取硫酸长春新碱对照品储备液（0.1 g/L），用70％（体积分数）甲醇配制成1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mg/L的系列溶液，滤过，HPLC测定；以峰面积（A）对质量浓度（ρ）线性回归，得回归方程A=14.5ρ+3.1（r=0.999 9），线性范围1.0～12.5 mg/L。
　　2.1.5 硫酸长春新碱脂质体药物回收率测定
　　 取0.8，1.0，1.2 g/L的硫酸长春新碱溶液各1 mL，分别加入空白脂质体0.2 mL和Na2HPO4溶液0.8 mL，制备不同浓度硫酸长春新碱脂质体。取各浓度脂质体各0.3 mL分别置于5 mL量瓶中，以去离子水定容，摇匀，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，滤过，HPLC法测定。代入标准曲线计算药物含量，进而计算回收率。结果表明，硫酸长春新碱脂质体中药物回收率为98.1%～101.8%。
　　2.1.6 硫酸长春新碱脂质体包封率的测定
　　1.2”中硫酸长春新碱脂质体0.3 mL两份，一份置5 mL量瓶中，以去离子水定容，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混匀，滤过；另一份上阳离子树脂柱，以去离子水洗脱，收集5 mL洗脱液，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混匀，滤过。HPLC测定，计算包封率：包封率=A过柱/A未过柱，其中A过柱表示脂质体包封的硫酸长春新碱的色谱峰面积；A未过柱表示总的硫酸长春新碱的色谱峰面积。
　　 结果表明，硫酸长春新碱脂质体的包封率为86.9％，长循环硫酸长春新碱脂质体包封率提高到92.8％。
　　2.2 硫酸长春新碱脂质体体外释放度的考察
　　2.2.1 分析方法建立
　　 将4 mL空白脂质体装入预处理好的透析袋中，于37 ℃生理盐水（100 mL）中透析10 h，取外层透析液用紫外分光光度计于298 nm测定吸光度（λVCR 297.8 nm），吸收值为零。说明空白脂质体在10 h内未通过透析袋，可采用透析法测定硫酸长春新碱脂质体的体外释放度。
　　2.2.2 硫酸长春新碱脂质体体外释放度的测定
　　 取硫酸长春新碱溶液、硫酸长春新碱脂质体和长循环硫酸长春新碱脂质体各4 mL，分别加入预处理好的透析袋中，再分别置于37 ℃生理盐水中透析，定时取透析液2 mL，并补加等量生理盐水。将透析液滤过，测定药物浓度，计算通过半透膜的药物累积释放量Mt，进而计算累积释放度，结果见图1。
　　Mt=cnV0+∑ni=1ci-1V
　　其中，V0为释放介质体积，cn为第n次取样时浓度，V为取样体积。
　　图1 硫酸长春新碱溶液和脂质体累计释放度

Fig.1 Fractional release of vincristine sulfate liposomes
　　with different compositions
　　 将硫酸长春新碱脂质体和长循环硫酸长春新碱脂质体中药物累积释放度（F）对时间(t)线性拟合，方程分别为F=3.1t+0.9 (r=0.998 5)和F=0.8t+0.7 (r=0.998 0)，表明两种脂质体均符合零级释药模型。由方程斜率可知，CHSPEG2000修饰可降低脂质体中药物释放速率，10 h硫酸长春新碱的释放度由32.43%降低到8.6％。
　　2.3 硫酸长春新碱脂质体血浆释放度的考察
　　2.3.1 硫酸长春新碱水溶液标准曲线制备
　　 取硫酸长春新碱对照品储备液（1.0 g/L），用去离子水配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中，分别以甲醇定容。HPLC法测定，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归，方程为A=19.0ρ+2.7（r=0.999 6），线性范围2.0～20.0 mg/L。
　　2.3.2 硫酸长春新碱血浆溶液标准曲线制备
　　 取硫酸长春新碱对照品储备液（1.0 g/L）用血浆配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中甲醇定容，混匀，15 000 r/min离心5 min，取上清液过滤进样，得回归方程A=18.3ρ+2.3（r=0.998 9），线性范围2.0～20.0 mg/L。
　　2.3.3 血浆中硫酸长春新碱回收率的测定
　　 配制5.0，10.0，15.0 mg/L的硫酸长春新碱血浆溶液，按“2.3.2”方法操作，HPLC测定A，代入水溶液标准曲线，求算药物浓度，并计算回收率。结果表明，血浆中药物回收率为97.9％～102.1% 。
　　2.3.4 阳离子树脂对血浆中硫酸长春新碱的吸附
　　 配制系列浓度的硫酸长春新碱血浆溶液（40～120 mg/L），37 ℃水浴孵化10 min，各取1 mL溶液，分别上阳离子树脂柱，以去离子水洗脱，收集洗脱液，取2 mL置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，HPLC法测定。结果表明，过阳离子树脂的溶液未检测出硫酸长春新碱，说明阳离子交换树脂能完全吸附血浆中游离和蛋白结合的硫酸长春新碱，此法可以检测脂质体的血浆释放度。
　　2.3.5 硫酸长春新碱脂质体血浆释放度的测定
　　 取硫酸长春新碱脂质体和长循环硫酸长春新碱脂质体各4 mL（CVCR 0.5 g/L），分别与20 mL血浆混匀，37 ℃定时取样1 mL，上阳离子树脂柱，以去离子水洗脱，收集洗脱液，取2 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容。HPLC法测定，计算释放度，结果见图2。结果表明，硫酸长春新碱脂质体和长循环硫酸长春新碱脂质体在血浆中24 h分别释放61.5%和51.4%。
　　2.4 硫酸长春新碱脂质体的药效学研究
　　 将复苏的S180细胞接种于小鼠腹腔内，约5天抽出腹水用生理盐水稀释后传代。将接种S180肿瘤的小鼠随机分为4组：模型组、硫酸长春新碱溶液组、硫酸长春新碱脂质体组、长循环硫酸长春新碱脂质体组，每组10 只，右侧腋下接种(0.2 mL/只)，第3、6、9、12 天尾静脉注射给药，第15 天将小鼠拉断颈椎处死，剥离瘤体称重。结果表明，各给药组与模型组比较，差异均有显著性（P<0.01）；长循环脂质体组与溶液组比较，差异有显著性（P<0.05），而脂质体组与溶液组差异则无显著性，见表1。表1 各组瘤重结果
　　3 讨 论
　　3.1 脂质体血浆释放度作为体外检测手段可以为体内释放度的预测提供依据。本文采用阳离子树脂分离血浆中的脂质体和硫酸长春新碱，用HPLC法测定脂质体包封的药物含量，进而计算硫酸长春新碱脂质体释放度。结果表明，长循环脂质体比硫酸长春新碱脂质体药物释放度低，说明长循环硫酸长春新碱脂质体体内循环时间延长，更有利于发挥药效。
　　3.2 药效学试验中，用SPSS10.0统计软件对各组瘤重进行多样本均数间多重比较。结果表明，各给药组与模型组比较，差异均有显著性（P<0.01）；长循环脂质体组与溶液组比较，差异有显著性（P<0.05），而脂质体组与溶液组差异则无显著性。其原因可能是，脂质体静脉给药后易被网状内皮系统细胞，特别是单核吞噬细胞作为外来异物吞噬，且体内成分会导致脂质膜破坏，使药物渗漏，不能更好发挥药效；CHSPEG2000修饰的长循环脂质体可以避开单核吞噬细胞的吞噬，使更多药物到达肿瘤部位发挥疗效。因此，长循环硫酸长春新碱脂质体可以明显提高抑瘤率，增强疗效。
　　3.3 CHSPEG2000为本实验室合成的一种新型脂质体修饰材料。脂质体形成过程中，CHSPEG2000分子的胆固醇端嵌入脂质体膜中，PEG端向外伸展形成亲水层。在体外PEG层可以防止脂质体因融合而造成的药物渗漏和粒径增大，并能提高脂质体的包封率；在体内PEG层可以防止脂质体被巨噬细胞吞噬，有助于更好的发挥药效。

参考文献

［1］LAYTON D， TROUET A. A comparison of the therapeutic effect of free and liposomally encapsulated vincristine in leukemia mice［J］. Eur J Cancer，1980，16: 949.