作者：梁海荣，唐焕文，胡大林，庄志雄

【关键词】 苷二磷酸核
　　【摘要】 目的：通过检测人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7个外显子核苷酸多态性，了解在广东的汉族人群中hPARP1基因多态性分布，为建立民族特色的DNA修复基因多态性数据提供基础资料。方法： 选取在广东地区的汉族健康人群320名的基础资料及血液样本，抽提血液DNA，用PCR法扩增hPARP1基因7个外显子，采用聚合酶链式反应（PCR）单链构象多态性(SSCP)和银染技术检测hPARP1基因多态性，并进行DNA序列测定。结果： 在广东的汉族正常人320名血标本的7个外显子扩增产物SSCP电泳条带中，4个样本hPARP1基因外显子17的SSCP电泳条带检出1条多态性条带，3个样本第12 内含子检出1条多态性条带，其余6个外显子扩增产物SSCP电泳未见多态性条带。正常带型DNA测序结果与genebank中已知序列完全一致，第17外显子上有1种基因突变类型（T→C）。结论： 在广东地区的汉族人群的hPARP1基因第17外显子和第12 内含子上可能存在多态性。
【关键词】聚腺苷二磷酸核糖聚合酶－1；遗传多态性；聚合酶链反应
【Abstract】 Objective: To investigate the nucleotide polymorphisms and distributions of seven exons in human poly (ADPribose) polymerase1 (PARP1) gene and to contribute to the construction of the special DNA repair gene polymorphisms databank. Methods: The basic materials and blood samples from 320 Guangdong health Han population were collected. The polymorphism of exon 3，11，12，13，16，17 and exon 20 of hPARP1 gene were detected by PCRSSCP， and sequencing test were performed. Results: A polymorphisms of exon 20 of PARP1 gene was detected in 320 Han people by PCRSSCP， no abnormal bands were observed from the analysis of PCRSSCP in other exons. Also， DNA sequence of normal bands turned out that PCR products were target ones in Genebank， one type mutations (T→C) and (G→A)were detected in exon 17 and in intron 12. Conclusion: Polymorphisms may exist in exon 17 and intron 12 of hPARP1 gene in Guangdong Han population. PCRSSCP silver staining could be as a tool to screen rapidly the polymorphisms hPARP1 gene.
【Key words】 poly (ADPribose) polymerase1; genetic polymorphism; polymerase chain reaction　　
DNA修复系统在修复DNA损伤、维持基因组完整和稳定性中起着不容忽视的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly (ADPribose) polymerase1，PARP1］是真核细胞中存在的一种蛋白质翻译后修饰酶。可参与许多与细胞功能有关的重要反应，并与癌症的发生、发展和治疗、预后密切相关，对维持DNA的完整性方面起着重要的作用［1］，其多态位点的确认对疾病易感性的流行病学研究具有重大意义。基因检测能有效筛查基因突变携带者，可以为进一步鉴定该突变功能上的意义提供基础的分子遗传学资料，因而具有重要的意义。本文应用PCRSSCP基因筛查技术和分子流行病学方法检测了在广东的汉族人群中正常人hPARP1基因的多态性，为hPARP1基因多态性人群分布和建立民族特色的DNA修复基因多态性数据库提供基础资料。现将结果报道如下。
1 方法
1.1 样本收集
选取在广东地区的健康状况良好(通过体检选择取)、无家族史和遗传病史、三代及以上均为汉族的320名个体（其中男174例，女146例，年龄38～67岁，平均年龄（43.15±6.70）岁）并取血样标本。
1.2 血液DNA的抽提［2］
采集外周抗凝全血5 mL，用经典酚氯仿法提取外周血DNA，并在4 ℃保存。
1.3 引物设计
根据已确定的hPARP1基因cDNA和内含子/外显子连接序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计hPARP1基因7个外显子的引物，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (表1) 。表1 扩增hPARP1基因外显子的引物序列
　1.4 PCR扩增
PCR反应总体积为25 μL，各成分终浓度为：引物0.125 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+1.8 mmol/L，DNA模板25～250 ng，Taq DNA聚合酶2.5u。反应参数为：98　℃预变性5 min，94 ℃ 30　s，53～59 ℃ 30　s，72 ℃ 45　s，30次循环后72 ℃延伸8 min。以2％ 琼脂凝胶对扩增产物进行鉴定。若与DNA分子量标准相比，扩增产物大小一致，无杂带，则可用于单链构象多态性(SSCP)分析。
1.5 SSCP分析
1.5.1 8％聚丙烯酰胺凝胶的配制 40％丙烯酰胺8 mL，10×Tris/硼酸电泳缓冲液 (TBE) 4 ml，10％过硫酸胺（AP）0.8 mL，N，N，N′，N′四甲基乙二胺(TEMED)53 μL，甘油4 mL，加水至40 mL。将聚丙烯酰胺凝胶混合物倒入玻璃板夹层，插入梳子，让凝胶在室温下聚合40～50 min，拔出梳子，冲洗样孔。根据PCR产物的浓度，取0.2～2 μL产物加入20 μL甲酰胺变性液（98％去离子甲酰胺，0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯青）中混匀，95 ℃热变性5 min，立即置于冰上，点样于预电泳30 min的上述8％聚丙烯酰胺凝胶中，在4～8 ℃环境中300V电泳6～10 h。
1.5.2 银染步骤 参照文献［3］进行(1) 10％ 乙醇浸泡5 min；(2) 1％ HNO3浸泡5 min；(3) 0.2％ AgNO3 浸泡20 min；(4)显影液(20 mL 1.4 mol/L 无水碳酸钠＋50μL甲醛＋80 mL去离子水)，至条带出现；(5) 10％ 醋酸浸泡5 min。以上每一步后均用去离子水洗2次，观察结果并扫描成像保存。对阳性结果样本进行2～3次PCRSSCP银染重复试验。
　1.6 DNA序列测定
对SSCP分析有异常泳动带的外显子，扩增DNA样本，采用ABI377 全自动基因分析仪对其进行DNA序列测定并与GeneBank中所报道的序列进行比较。
2 结果
2.1 DNA抽提结果
所抽提DNA样本浓度及纯度，均可用于后续实验研究。

转贴于 免费论文下载中心 2.2 PCR扩增
320份DNA样本的hPARP1基因7个外显子均得到成功扩增，各外显子PCR反应产物均为单一条带，大小在175～362bp之间，与预计扩增片断大小一致 (图1) 。
2.3 SSCP分析
经PCRSSCP对7个外显子进行遗传多态性检测，320名汉族人中有4名的外显子17和3名测序检出内含子12出现多态位点，出现2种稳定的带型，显示3条变性单链带（异常泳动条带位置在2条正常单链的中间），其余6个外显子均未发现异常带型，显示2条变性单链带（图2）。
2.4 测序
正常样本7个外显子双向测序结果表明，所扩增序列分别与Genbank中hPARP1基因7个外显子的符合率达到100％。4例异常样本第17外显子和3例异常样本第12外显子测序结果，所扩增序列有一处碱基发生突变，外显子17在密码子808处出现CAC→CGC，即组氨酸→精氨酸；第12外显子测序发现12内含子在18731位出现G→A改变(图3，图4)。
1～8泳道分别为外显子20、17、3、11、 DNA Mark DL2000及外显子12、13、16。
图1 PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳结果　　 第6泳道为异常标本，其余泳道为正常标本；“↓”：正常单链，“←”：异常单链。
图2 hPARP1基因外显子17 PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上的电泳图
第12 内含子的18731位出现G→A的杂合性突变。
图3 第12 内含子正向测序图　　异常泳动条带样本第17 外显子反向测序结果：密码子808出现T→C的杂合性突变。
图4 第17 外显子反向测序图3 讨论
PCRSSCP银染技术是一种检测基因突变非常敏感的方法。在大样本量的分子流行病学研究中， 往往需要对多个基因或同一基因的多个外显子进行突变筛查， 这种工作不仅工作量大， 耗费大， 操作繁琐， 而且不易进行质量控制。本实验结果表明，SSCP多重PCR 法是一种快速检测正常人群hPARP1 基因多态性的有用技术。它比用于检测基因突变的其它方法［4］，如变性梯度凝胶电泳法、限制性片段长度多态性和直接测序更简单、更省财省力，适用于大样本量人群的基因突变筛查和分子流行病学研究。
由于DNA 单链的构像是未知的，SSCP的条件应基于不同大小的DNA 片段，一般是靠经验来决定的，同时电泳温度和凝胶浓度能明显影响电泳的速度和单链DNA 分子的分辨率。SSCP不能确定碱基改变的准确数量或改变的位点，突变位点的准确定位必须依靠直接测序来完成。我们在SSCP 检测中发现有异常泳动条带的样本时，重新扩增其DNA 进行序列分析，结果均有基因突变。由此可见，SSCP 检测结果与直接测序结果的符合率高。在所有320份标本中仅检出4份样本的第17 外显子上的突变位点，其余6个外显子均未检出突变位点。与本室以前研究结果［3］相比，检出率有提高。这是与本实验始终在同一电泳环境温度(4℃)、凝胶浓度下对7个外显子进行电泳有关，还是与抽样有关呢？其确切原因有待进一步研究。
本研究用PCRSSCP法在320名广东地区汉族人群中筛查出4名的hPARP1基因第17 外显子有一种错义突变，检出3例第12 内含子有1种碱基突变发生。由于所检测出的突变位点尚未见报道，因此无法与其他国家或民族的基因频率进行比较。同时，第17外显子基因频率大于1％，因而这一位点为多态性位点，可能成为一种有用的生物标记，但要确证这一结论，有待增大样本含量做进一步研究。
目前除了本室对hPARP1基因多态性做了初步的探讨外，还未见有其他学者报道。我们成功地利用PCRSSCP法筛检了hPARP1基因7个外显子在广东地区汉族人群中多态性分布情况，为进行大样本量的人群筛查提供了一种有效的方法。因而，进一步研究不同民族不同地区人群的hPARP1基因多态性分布的性质和特点，对于研究不同民族的亲缘关系以及民族起源问题都有重要的科学价值［5］。

参考文献

［1］ REN Z F， ZHUANG Z X. Poly(ADPribose)polymerase， cell apoptosis and cancer［J］. Cancer Res Prev Treat，2000，27(3):236239.
［2］ 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术［M］. 2版. 北京:中国协和医科大学出版社，1999:108~109.
［3］ 唐焕文，庄志雄，梁海荣，等. 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1多态性的检测［J］. 中国公共卫生， 2003，19(10):11661168.
［4］ KURVINEN K， HIETANEN S， SYRJANEN K， et al. Rapid and effective detection of mutations in the p53 gene using nonradioactive singlestrand conformation polymorphism (SSCP) technique applied on Phast System［J］. J Virol Methods， 1995， 51(1): 43 53.
［5］ 唐焕文，庄志雄，梁海荣，等. 中国汉族、布依族和壮族群体中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1基因多态性［J］. 中山大学学报(医学科学版)，2003，24(5):432438. 免费论文下载中心