【摘要】 　　目的：研究双链短干扰RNA（siRNA）对白血病多药耐药细胞模型（K562/NaB）肺耐药相关蛋白（LRP）表达及功能的影响. 方法： 针对LRP基因设计合成特异性siRNA，在脂质体介导下转染K562/NaB；采用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测K562细胞LRP mRNA的水平；用流式细胞术检测K562/NaB细胞LRP蛋白表达的变化和细胞内柔红霉素（DNR）的蓄积；MTT法检测阿霉素（ADM）对K562/NaB细胞耐药的半数抑制浓度（IC50）. 结果： siRNA转染后：K562/NaB细胞的LRP mRMA水平明显降低；LRP蛋白表达由阳性转为阴性；细胞内DNR的蓄积明显增加，DNR平均荧光增强3.28倍；对ADM药物敏感相对逆转效率为78.18%. 结论： siRNA可逆转由LRP介导的白血病细胞多药耐药.
【关键词】 RNA，小分子干扰；基因，肺耐药相关蛋白；K562细胞；抗药性，多药
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of short interfering RNA (siRNA) on expression and function of lung resistancerelated protein (LRP) in the multidrug resistant human leukemia cells (K562/NaB). METHODS: Multidrugresistant K562 cells with high level LRP expression treated with sodium butyrate (NaB)， was used as an in vitro model system. LRP specific siRNA was synthesized and transfected into the K562/NaB cells. Expression of LRP mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR)， and protein level and intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/NaB cells were detected by flow cytometry. 50% inhibition concentration (IC50) of adriamycin (ADM) on K562/NaB cells was detected by MTT method. RESULTS: LRP mRNA level was decreased obviously; the protein expression was turned from positive result to negative result. Intracellular DNR accumulation was increased and the mean fluorescence of DNR was 3.28 times higher. The relative efficiency to ADM was 78.18％. CONCLUSION: The siRNA could effectively reverse the multidrug resistance of leukemia cells induced by LRP.
　　【Keywords】RNA， small interfering; gene， lung resistancerelated protein; K562 cells; drug resistance， multiple
　　0引言
　　肺耐药相关蛋白（lungrelated resistant protein， LRP）是一种新型的与多药耐药（multidrug resistance， MDR）相关的糖蛋白，主要导致细胞内药物聚集缺陷，而在多种肿瘤细胞内引起MDR. 在儿童白血病以及成人髓系白血病（AML）中，LRP表达是独立的预后决定因素之一，其过度表达造成患者对化疗不敏感，提示预后不良［1-2］. 双链短干扰RNA（short interfering RNA， siRNA）介导的RNA干扰（RNA interference， RNAi），是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面的最新突破［3-4］. 我们在建立了经丁酸钠（sodium butyrate， NaB）诱导人AML系 K562细胞，高表达LRP并介导多药耐药的细胞模型（K562/NaB）的基础上［5］，设计合成了LRP特异性siRNALRP，并转染上述细胞模型，观察siRNALRP抑制LRP基因和蛋白表达、消除LRP改变细胞内药物蓄积和分布作用的效果，以期为逆转LRP介导的肿瘤细胞MDR、提高儿童难治性和复发性白血病化疗效果探索新的方法，并探讨以siRNA介导的RNAi用于肿瘤细胞MDR治疗的可行性.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　AML细胞系K562细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；单克隆抗体LRP56为Monosan公司产品；固定和破膜试剂盒、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光标记羊抗鼠IgG抗体为Caltolog Laboratories产品；NaB为Sigma公司产品. 　　
　　LRP特异性短干涉RNA(siRNALRP)自行设计，由Dharmacon公司合成. 浓度20 μmmol/L，序列：5′ GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT （正义链），dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5′ （反义链）.
　　1.2方法
　　1.2.1K562细胞培养和高表达
　　LRP的K562多药耐药细胞模型（K562/N）［10］K562细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃， 50 ml/L CO2条件下培养. K562细胞在含2 mmol/L NaB的培养液中处理3 d，制作K562细胞高表达LRP的多药耐药细胞模型，命名为K562/NaB. 阴性对照组不加NaB.
　　1.2.2siRNA转染
　　实验K562/NaBsiRNA组：取K562/NaB细胞接种于24孔板内，每孔500 μL，浓度为3×108/ L. 分别以无血清RPMI 1640培养液 50 μL稀释siRNALRP， Lipofectamine各1 μL，混匀静置后加入细胞悬液. 再加入NaB使终浓度为2 mmol/L，进行细胞培养. 每24 h以含2 mmol/L NaB的RPMI 1640培养基500 μL换液，连续3 d. 转染后24， 48， 72 h分别取细胞进行相关检测. 　　
　　K562/NaBH2O组：取K562/NaB细胞，以无RNase水代替siRNALRP转染细胞，操作方法、实验条件同siRNA转染组. 取转染72 h细胞进行检测. 　　
　　对照组： K562/NaB细胞作为阳性对照；原始的K562细胞作为阴性对照.
　　1.2.3RTPCR方法检测
　　K562细胞LRP mRNA水平同时取实验和对照组细胞各1×106，以Trizol提取总RNA，以RTPCR检测LRP mRNA水平. 反转录以Oligo(dt)15作为引物，37℃ 1 h. PCR引物：LRP上游引物：5′GAT CCG ACC AGT CAG AAG CCG AG3′，下游引物：5′AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3′，扩增产物300 bp. 内对照GAPDH上游引物：5′AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3′，下游引物：5′CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3′，扩增产物590 bp. 扩增条件：95℃ 1 min，然后按94℃ 40 s， 58℃ 45 s， 70℃ 45 s，循环 30次，最后以72℃ 10 min结束反应. RTPCR产物电泳，LRP条带和GAPDH条带吸收峰比值LRP/GAPDH>0.3，视为LRP mRNA表达阳性.
　　1.2.4流式细胞术检测
　　K562细胞LRP蛋白表达以LRP的单克隆抗体LRP56为一抗，PE标记的羊抗鼠IgG为二抗，标记各组K562细胞，在流式细胞仪上检测其LRP蛋白的表达情况. 同时取实验和对照组的细胞各1×106，依次加入前固定液、打孔剂和LRP56单抗混合物、PE标记羊抗鼠IgG，避光保存. 各步骤间以含1 ml/L 叠氮钠、100 ml/L 小牛血清的PBS 洗涤细胞2次. 标记4 h内上流式细胞仪检测LRP蛋白表达，LRP阳性细胞>5%视为阳性结果.
　　1.2.5流式细胞术检测
　　细胞内柔红霉素（daunorubicin， DNR）蓄积同时取K562/NaBsiRNA组转染72 h的细胞、K562/NaBH2O组和阳性对照、阴性对照细胞各2×106，在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中调整细胞浓度为1×109/L，加入DNR使终浓度为1 μmol/L，于37℃， 50 mL/L CO2，饱和湿度条件下培养2 h. 洗涤后立即以流式细胞仪FL 2通道在相同条件下随机检测10 000个细胞. 以不加DNR的K562细胞作为空白对照.
　　1.2.6MTT法检测
　　ADM的IC50同时取K562/NaBsiRNA组转染72 h的细胞、K562/NaBH2O组和阳性对照、阴性对照细胞，调整细胞浓度至1×108/L，在96孔板的各孔中加入180 μL细胞和不同浓度（0.1 μg ~100.0 μg）的ADM，培养72 h后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，继续孵育4 h，570 nm波长处测定吸光度（A）值. 按以下公式分别计算相对逆转效率. 相对逆转效率=（IC50A- IC50B）/（IC50A-IC50C）. 其中IC50A是K562/NaB细胞的IC50，IC50B是转染siRNA的K562/NaB细胞的IC50，IC50C是K562细胞的IC50.

　　统计学处理：采用χ2检验和OneWay ANOVA检验. P<0.05认为具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1K562/NaB细胞LRP mRNA水平的变化
　　K562/NaBH2O组、阴性对照、阳性对照LRP mRNA表达阳性，其中阴性对照LRP/GAPDH 0.53，H2O转染组、阳性对照LRP/GAPDH分别为0.96， 0.98，较阴性对照明显升高. K562/NaBsiRNA组中，转染24， 48， 72 h， LRP mRNA检测均为阴性，较K562/NaBH2O组、阳性对照、阴性对照明显减低（图1）.
　　2.2K562/NaB细胞LRP蛋白表达的变化
　　K562/NaBsiRNA组转染48 h和72 h的细胞、阴性对照细胞LRP表达阴性；K562/NaBsiRNA组转染24 h的细胞、H2O转染组、阳性对照LRP表达阳性. 当阴性对照LRP阳性率为1.77%时，K562/NaBH2O组、阳性对照LRP阳性表达率分别为36.11%和35.10%，后二者LRP表达无明显差异（P>0.05）；K562/NaBsiRNA组中，转染24 h， 48 h， 72 h后，LRP阳性率分别为14.98%， 1.39%和1.55%，转染24 h后LRP表达较K562/NaB H2O组、阳性对照明显减少（P<0.01）；转染48， 72 h后， LRP阳性表达较转染24 h明显减少（P<0.01）.

免费论文下载中心 　　2.3DNR在K562/NaB细胞内蓄积的变化
　　加入DNR的实验组细胞出现明显的荧光，未加入DNR的空白对照K562细胞检测到微弱荧光（平均荧光强度为4）. K562/NaBH2O组和阳性对照细胞内DNR平均荧光强度分别为38和36；阴性对照K562细胞平均荧光强度为115；K562/NaBsiRNA组转染72 h的K562细胞内DNR平均荧光强度为118，较K562/NaBH2O组细胞内DNR平均荧光强度增强了3.28倍(图2).
　　2.4K562/NaB细胞药物敏感性的变化
　　siRNALRP作用72 h后的K562/NaB细胞对ADM的敏感性增加，药物敏感相对逆转效率为78.6%（表1）. 表明siRNALRP可以恢复K562/NaB细胞对化疗药物的敏感性. 表1siRNAs对ADM作用于K562/NaB细胞的IC50的影响（略）

　　3讨论
　　在多种生物中，外源双链RNA（double stranded RNA， dsRNA）导入细胞中，与其同源的mRNA受到降解，其相应基因受到抑制，称为RNA干涉（RNA interference， RNAi）［6-8］. 研究表明［9-10］，体外合成的小分子dsRNA能直接触发RNAi，这些小分子dsRNA被称为小干涉RNA（small interfering RNA），即siRNA. siRNA介导RNAi的机制主要由RNAi核酸酶催化，该酶包括一个dsRNA结合区，一或多个RNA酶区域，以及一个RNA解旋酶区域. 首先dsRNA与RNA核酸酶结合，并被分解成为的2123nt的 siRNA，与该酶稳定结合形成360 kDa的蛋白质RNA复合体. siRNA特异地与同源mRNA结合，解旋酶区域催化mRNA与siRNA的正义链交换. 最终mRNA被降解，并再生成siRNA与RNAi核酸酶的复合体. 目前，RNAi技术以其高效性、特异性，在基因沉默中得到广泛应用，对于肿瘤细胞多药耐药基因的消除是其应用的热点之一.
　　我们设计合成了针对LRP的特异性siRNA，用以转染K562细胞高表达LRP的细胞模型，初步探讨特异性siRNA降解LRP的mRNA、降低LRP蛋白的表达的作用、消除LRP的药泵功能的效果. 本研究的发现，以siRNALRP转染NaB诱导3 d的K562细胞，转染24 h，LRP mRNA水平明显下降，转为阴性；LRP蛋白水平明显下降；转染48 h， 72 h， LRP LRP mRNA和LRP蛋白表达仍均为阴性. 在LRP改变细胞内化疗药物蓄积和对化疗药物耐药性方面，经siRNALRP转染72 h，K562/NaB细胞内DNR蓄积增加，恢复到原始的K562细胞水平，对ADM的耐药性明显降低.
　　上述结果表明，siRNALRP能够有效降解K562细胞LRP mRNA，使LRP蛋白表达受到抑制，并因此消除了LRP介导的MDR作用，因此有望成为逆转LRP介导肿瘤细胞MDR的有效方法.

参考文献

　　［1］List AF， Spier CS， Grogan TM， et al. Overexpression of the major vault transporter protein lungresistance protein predicts treatment outcome in acute myeloid leukemia［J］. Blood， 1996， 87: 2464-2469.